ИФА В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ
И.Н.МАТВЕЕВА ВНИТИБП
журнал "Ветеринария" №6 2007
Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) при оптимальном соотношении себестоимости и чувствительности - действенный инструмент в ветеринарной лабораторной практике.
ИФА можно использовать для выявления практически любой иммунореактивной молекулы. Преимущества его в том, что он не зависит от клеточных культур, применим для массового скрининга, результаты можно получить в течение нескольких часов. Среди разнообразных вариантов данного способа часто применяют непрямой метод ИФА, где антиген возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек (ВД-БС) мобилизуется на полистироловом носителе и взаимодействует со специфическими антителами, которые затем выявляют с помощью конъюгированных с ферментом антиглобулинов и хромогенного субстрата. Специфичность этой тест-системы определяется выбором антигена, который может быть очищенным вирусом [4, 6], детергированным экстрактом культуры клеток, инфицированной вирусом ВД-БС КРС [1, 8], либо рекомбинантными вирусными протеинами, продуцированными в бактериальных клетках [9]. Другой распространенный вариант -конкурентный ИФА, где вирусспецифические антитела в исследуемой сыворотке конкурируют или блокируют конъюгированные вирусспецифические антитела, что приводит к снижению интенсивности окрашивания положительного образца [12]. Разработано значительное количество вариантов ИФА для выявления антигенов вируса ВД-БС КРС с применением высокоспецифичных моноклональных антител (МКАЩ13, 14, 16].
Для определения специфических антител к вирусу ВД-БС КРС в сыворотке и плазме крови, пробах молока J.I. Kramps et al. (1999) разработали блокирующий вариант ИФА ("Ceditest") с использованием 2 моноклональных антител, направленных против высококонсервативного эпитопа неструктурного протеина NS3.
Специфические антитела к вирусу ВД-БС КРС классифицируют на 2 группы: первая -антитела к вирусным гликопротеинам, главным образом Е2 или др 53, которые блокируют инфекционность и нейтрализуют вирус ВД-БС.
Они перекрестно реагируют со многими штаммами ВД-БС КРС [5]; вторая - антитела к иммуногенному неструктурному вирусному протеину NS 2 - 3 (р125) - очень важному для внутриклеточной репликации вируса. Антитела к нему не нейтрализуют вирус, но их можно определить разными серологическими тестами ( V. Moenning, 1991).
Использование ИФА для исследования сборных проб молока позволяет значительно снизить затраты на проведение оздоровительных мероприятий. Контроль противовирусных антител в сборных пробах молока коров, невакцинированных против ВД-БС, дает информацию об инфицированное™ вирусом ВД-БС стада и присутствии в нем персистентно инфицированных животных (R. Niskanen, 1989, 1993; S. Alenius et al., 1997; V. Bitsch et al.,1997;S. Waageetal., 1997; J. Kramps, 1999). Данный тест удобен при длительном наблюдении эа благополучными стадами, находящимися в ареале инфекции, а появление в них серо-позитивных коров позволяет принимать срочные меры по ликвидации инфекции.
Техника амплификации in vitro также может быть использована для детекции вирусной нуклеиновой кислоты в пробах молока (G. Radwan, 1995; T.W. Drew, 1999). Данный тест пригоден для поиска в стадах персистентно инфицированных животных, вакцинированных против ВД-БС КРС, однако не все они в момент проведения исследования лактируют, поэтому метод имеет только вспомогательное эпидемиологическое значение.
Диагноз на персистентную инфекцию вирусом ВД-БС КРС считают подтвержденным при повторном выделении вируса в образцах без сероконверсии через 3-4 нед. У животных с острой инфекцией ВД-БС титр вируса в крови был обычно низкий и регистрировали его непродолжительное время. Антитела в сыворотке крови животных, перенесших острую инфекцию ВД-БС, определяли в течение года [8].
Результаты серологического мониторинга, проведенного методом ИФА у разных возрастных групп животных, дают информацию об инфицированности стада. Косвенным подтверждением персистентной инфекции у животного может служить отсутствие антител против вируса ВД КРС при высоких титрах антител у животных, контактирующих с данным индивидумом. Если при проверке сыворотки крови, взятой через 3-4 нед, обнаружили высокий титр антител, то это свидетельствует о пиковой фазе инфекции.
Выделяют 5 фаз в инфекционном цикле развития болезни (см. таблицу). Контролируя титры антител в сыворотке крови молодых
Характеристика фаз инфекционного цикла развития ВД-БС крупного рогатого скота
Фаза Краткая характеристика
А Недавно инфицированное стадо без присутствия персистентно инфицированных животных, только незначительный процент особей может быть серопозитивен
В Инфицированное стадо с персистентно инфицированными телятами моложе 3-4-месячного возраста, многие животные переносят острую инфекцию
С Инфицированное стадо с персистентно инфицированными телятами старше 3-4-месячного возраста, более чем 90 % животных серопозитивны
Д Ранее инфицированное вирусом стадо, но персистентно инфицированные животные к этому времени уже могут быть удалены из стада. Молодые животные не имеют антител к вирусу ВД-БС, так как до 6-8-месячного возраста освобождаются от колострапьных антител к вирусу. Взрослые коровы остаются серопозитивными
Е Ранее инфицированное стадо, если персистентно инфицированные животные удалены несколько лет назад. Все молодые животные (кроме телят с колостральными антителами к данному вирусу), и многие молодые коровы не имеют противовирусных антител животных методом ИФА, можно прогнозировать присутствие или отсутствие персистентно инфицированных вирусом ВД-БС животных. Для фаз С, Д и Е инфекционного цикла развития болезни характерно, что большинство проб сыворотки крови серопозитивны или серонегативны, а для фаз А и В - очень незначительное их количество серопозитивны [7].
Т. Sandvik (1999) после тестирования сыворотки крови невакцинированных животных в ИФА на наличие антител и антигенов вируса ВД-БС, распределял их на следующие категории: клинически здоровые персистентно инфицированные (старше 2-месячного возраста были всегда серонегативны и имели постоянно высокий уровень вируса в крови, слюне, фекалиях, моче); животные с острой инфекцией (непродолжительное время имели низкий титр вируса ВД-БС в крови) и т. п.
Заключение. Серологические исследования сывороток крови, молока или молозива животных методом ИФА позволяют более рационально и надежно организовать работу по профилактике и оздоровлению стад от данной инфекции. Хотя для подтверждения диагноза на ВД-БС требуются: изоляция вируса в культуре клеток, метод ПЦР для выявления генома вируса в биологических жидкостях и т.д.
журнал "Ветеринария" №6 2007
№ кошелька: 410011987169836