Выявление вирусных возбудителей гастроэнтеритов телят методом ПЦР

ВЫЯВЛЕНИЕ ВИРУСНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГАСТРОЭНТЕРИТОВ ТЕЛЯТ МЕТОДОМ ПЦР

П. К. АЯНОТ, А. М. ТИМИНА, С. А. ЧУПИН, В. А. КУДРЯВЦЕВ, М. И. ШУЛЬПИН, В. Ф. КОВАЛИШИН
вниизж

Острые расстройства пищеварения телят всех возрастов — одна из проблем современного животноводства. Во многих хозяйствах регистрируют отход молодняка первых дней жизни из-за болезней желудочно-кишечного тракта, протекающих с диарейным синдромом. Их возникновению способствуют следующие факторы: генетические, физиологические, санитарно-гигиенические и инфекционные. Последние в свою очередь, отличаются чрезвычайным многообразием и включают в себя большой набор вирусных, бактериальных, паразитарных возбудителей и грибов, которые чаще всего проявляются в виде смешанных инфекций.

Из-за сходства клинических, патолого-анатомических и эпизоотологических данных без лабораторных исследований невозможно установить конкретную причину болезни. Как правило, пусковым механизмом в патогенезе инфекции являются вирусы, после них в патологический процесс вступают бактерии, простейшие и грибы. В итоге животное погибает не от вирусов, а от осложняющих течение болезни микроорганизмов, которые зачастую являются условно-патогенными (Е. coli, энтеробактерии, актиномицеты). Поражение энтероцитов приводит к появлению профузного поноса, потере аппетита, что усиливает токсикоз, вызывает обезвоживание, сгущение крови и расстройство кровообращения. Затем возникает дисбактериоз, а гибель в большинстве случаев обусловлена бактериальными токсинами и септицемией.

Своевременное обнаружение возбудителей вирусной этиологии позволяет установить причину первичных диарей, избрать стратегию профилактики и лечения в каждом конкретном случае и таким образом ограничить потери молодняка, связанные с симптомокомплексом диареи.

В последнее время широкое распространение получили молекулярно-биологические методы выявления и характеристики возбудителей (полимеразная цепная реакция и секвенирование), которые используют и в нашей лаборатории. Преимущество полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в более высокой чувствительности и специфичности по сравнению с другими методами. С помощью ПЦР можно обнаружить вирус даже в минимальных концентрациях, которые нельзя выявить другими способами. ПЦР позволяет за несколько циклов размножить исходный геномный материал (ДНК или РНК вируса, находящуюся в патматериале) до концентрации, которую будут фиксировать менее чувствительные методы (электрофорез). Используя ПЦР, можно выявить практически любой возбудитель, за исключением прионных инфекций, например, губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота.

Методы секвенирования позволяют определять первичную структуру амплифицированных участков генома, а сравнительный их анализ — проводить штаммовую дифференциацию, в некоторых случаях серотипизацию, устанавливать филогенетическое родство, происхождение изолята и источник инфекции.

В настоящее время сотрудники нашей лаборатории разработали и применяют несколько тест-систем для выявления методом ПЦР ротавируса крупного рогатого скота (РВ КРС), коронавируса (KB КРС), парвовируса (ПВ КРС) и вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), которые являются основными возбудителями болезней телят с симпто-мокомплексом диареи. В патологии желудочно-кишечных инфекций молодняка принимают участие также энтеро-, адено-, калици-, торо-, рео-, астро- и герпесвирусы крупного рогатого скота, однако они встречаются значительно реже.

За 1999—2001 гг. исследовали образцы патологического материала от крупного рогатого скота из 50 хозяйств (в основном из областей Центрального федерального округа) для установления причин   гастроэнтеритов  телят,    наносящих значительный экономический ущерб. Заболеваемость животных в отдельных случаях (в период массовых отелов) достигала 90—100 %, а количество павших и вынужденно убитых — иногда 70—85 %. Тяжесть поражения органов пищеварительной системы варьировала от легкого катарального воспаления с кратковременным поносом до глубоких патологий большинства органов с наличием геморрагического, фибринозного, язвенно-некротического абомазоэнтерита с элементами интоксикации и сепсиса (кровоизлияния, дистрофия паренхиматозных органов, гиперплазия мезентериальных лимфоузлов, лимфоидного аппарата кишечника, селезенки), приводящих к гибели телят. В этих хозяйствах у молодняка часто наблюдали болезни респираторных органов, поражение слизистых и т. д.

Цель нашей работы — показать возможность применения молекулярно-биологических методов для выявления и характеристики возбудителей гастроэнтеритов телят (рота-, корона-, парвовируса и вируса диареи) и определить частоту их выделения у крупного рогатого скота.

Материалы и методы. Для обнаружения генома возбудителей кишечных инфекций методом ПЦР тестировали образцы внутренних органов, слизистой и содержимого кишечника телят, а также фекалии и носовые истечения. ПЦР и нуклеотидное секвенирование проводили общепринятыми методами

Результаты исследований и обсуждение. Указанные вирусы в основном локализуются в кишечнике. Энтероциты являются мишенями для репликации возбудителей данной группы. В процессе репродукции вирусные частицы разрушают клетки слизистой оболочки кишечника и выходят в просвет, обусловливая высокое накопление в содержимом кишечника и фекалиях.

Локализация каждого вируса в организме имела свои особенности. Например, рота- и парвовирус обнаруживали только в желудочно-кишечном тракте и фекалиях (табл. 1). Коронавирус выявляли также и в органах респираторной системы, так как он поражает преимущественно эпителиальные клетки респираторного и желудочно-кишечного трактов. Вирус диареи обычно регистрировали в слизистой оболочке кишечника и его содержимом, но чаще всего в легких, а иногда в носовых истечениях. У животных патологию органов желудочно-ки-

Таблица 1

Выявление возбудителей вирусных инфекций крупного рогатого скота, протеквющих с диарейным синдромом методом ПЦР

 

 

Органы и ткани трупов

и вынуж-

Биологи­ческие

 

денно убитых телят

ЖИДКОСТИ

Возбу­дитель

тра-

лег-

лим-

селе-

сли-

со-

фе-

но-

 

хея

кие

фати-

зен-

зис-

дер-

ка-

со-

 

 

 

че-

ка

тая

жи-

лии

вые

 

 

 

ские

 

ки-

мое

 

исте-

 

 

 

узлы

 

шеч-

ки-

 

че-

 

 

 

 

 

ника

шеч-

 

ния

 

 

 

 

 

 

ника

 

 

Ротави-

 

 

рус              -     —      —       —

++    ++

++     —

Корона-

 

 

вирус         ++     +       —       —

++    ++

++    ++

Парво-

 

 

вирус          —     —      —       —

++     +

+      —

Вирус

 

 

диареи       +     ++      +        +

++    ++

+     ++

Примечание: «++» — высокая вероятность об-

наружения вируса в органах, «+

» — средняя,«—» —

не выявляли.

 

 

шечного тракта и дыхательных путей наблюдали как вместе, так и по отдельности. По-видимому, для вирусной диареи слизистая дыхательных путей является воротами инфекции, поэтому уже на этом этапе отмечают клинические признаки болезни. В дальнейшем возбудитель распространяется по организму и его можно обнаружить почти во всех органах, но чаще всего в клетках слизистых.

Чаще всего из патологического материала выделяли вирус диареи более чем в 40 % случаев. При индикации его генома с помощью амплификации 5' нетранслируемой области, фланкирующей единственную открытую рамку считывая с 5' конца вирионной РНК, специфический фрагмент выявили у телят с наличием диарейного синдрома в 21 из 49 обследованных хозяйств.

Для вируса диареи существование серотипов не доказано, но есть дифференциация на генотипы. При этом представители разных генотипов отчетливо различаются между собой. Так, референтные и вакцинные штаммы, относящиеся к первому генотипу, имеют около 30 % отличий от представителей второго генотипа. У представителей разных генотипов также отмечены антигенные различия. Известны случаи, когда сыворотка, полученная против одного генотипа, не нейтрализовала инфекционную активность некоторых представителей другого генотипа. Вирус диареи второго генотипа преимущественно выделяли из сыворотки эмбрионов коров, от персистентно инфицированных телят, родившихся от матерей, привитых живой вакциной против вирусной диареи, и животных, погибших при остром течении диареи с геморрагическим синдромом .

Все выявленные нами изоляты относились к первому генотипу и имели 10— 20 % отличий от референтных штаммов NADL, Oregon и Osloss и 30 % — от изолятов второго генотипа (Waters и 890). Вирус диареи второго генотипа мы не выделяли ни разу, по-видимому, это объясняется крайне редкой встречаемостью данного генотипа на территории России.

Второе место по частоте выявления занимал ротавирус крупного рогатого скота, характеризующийся чрезвычайно разнообразной антигенной структурой. Одной из наиболее важных его антигенных характеристик является G-серотип, обусловленный свойствами белка VP7, вызывающего образование вируснейт-рализующих антител [10]. С помощью ПЦР и секвенирования фрагментов гена VP7 российских полевых изолятов установили относительную частоту встречаемости разных G-серотипов РВ КРС. Серотип G6 зарегистрировали в 58,3 % случаев, G8 —в 16,7, G10 — в 20,8 nG11 — в 4,2 %.

Нередко у телят наблюдали инфицирование одновременно 2 или более изолятами РВ КРС [7, 13]. Разработанная методика на основе ПЦР позволяет выявлять в одном образце патологического материала одновременно 2 или 3 изолята РВ КРС и дифференцировать их G-серотипы. Для этого в ПЦР используют пул серотипспецифических праймеров. На рисунке видно, что в реакции амплификации участвуют 2 праймера (GC1 и GC3), универсальные для ротавирусов серотипов G6, G8 и G10 (наиболее распространенные G-серотипы РВ КРС), а в реакции реамплификации — один универсальный праймер (GC2) и 3 серотипспецифических, парных праймеру GC2. Каждый из этих серотипспецифических праймеров отжигается на участке гена VP7 ротавирусов только одного из трех серотипов — G6, G8 или G10. Эти праймеры расположены на разном удалении от парного им праймера GC2, поэтому при тестировании образца, содержащего 2 или 3 изолята РВ, относящихся к разным G-серотипам, в продуктах реакции будут регистрировать 2 или 3 фрагмента соответствующего размера. С помощью разработанного метода при тестировании одного образца обнаружили одновременно 2 изолята РВ с серотипами G8 и G10. Используя анализ нуклеотидной последовательности участков генома, можно дифференцировать штаммы ротавирусов.

При использовании схемы ПЦР с праймерами, универсальными для ротавирусов всех известных G-серотипов, выявили полевой изолят РВ КРС, который предположительно отнесли к новому, ранее не описанному G-серотипу, так как он по уровню нуклеотидной гомологии фрагмента гена VP7 отличался от всех ранее изученных штаммов более чем на 34 %. Это свидетельствует о том, что антигенное и генетическое разнообразие РВ КРС изучено не полностью и представляет интерес для дальнейших исследований.

В патологическом материале от животных с кишечной и смешанной клинической картиной выделили РНК 16 полевых изолятов KB КРС [3]. В большинстве случаев при диарейном синдроме коронавирус у телят обнаруживали в 1—2-не-дельном возрасте. Данный срок проявления энтерической коронавирусной инфекции крупного рогатого скота — наиболее характерный и описан многими авторами, однако у телят возбудитель можно выделить в возрасте от 1 дня до 3 мес . В наших опытах геном KB КРС выявили у телят в возрасте от 2 дней до 2 мес.

Анализ нуклеотидных последовательностей вариабельных областей НЕ и S генов исследуемых изолятов подтвердил высокую консервативность вирусного генома. Первичная структура изолятов, выделенных в разное время в России, Америке и Европе, отличалась незначительно. Характерная особенность фрагмента НЕ гена (919—1147) в том, что замены возникают преимущественно по определенным позициям, причем в них в основном наблюдают лишь 2 варианта нуклеотидов. Это определяет высокую вероятность их случайного совпадения, что может обусловливать сходство нуклеотидных последовательностей филогенетически удаленных и значительную разницу филогенетически близких штаммов и изолятов вируса. Отмеченные особенности не позволяют судить о фило-генетической близости изучаемых штаммов на основании сравнительного анализа выбранного фрагмента НЕ гена. Данных, которыми мы располагаем на сегодняшний день, недостаточно для установления корреляции между степенью филогенетического родства разных штаммов KB КРС и уровнем сходства первичной структуры их генома. Однако вариабельность исследуемых фрагментов генома достаточна для штаммовой дифференциации, что имеет большое практическое значение, например, при дифференциации полевых изолятов от вакцинных штаммов вируса.

Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота, по нашим данным, встречалась довольно редко. Специфический фрагмент генома ПВ КРС обнаружили в образцах материала от 1,5—7-месячных телят из 6 хозяйств. Преимущественно это были сочетания желудочно-кишечной и респираторной патологии.

По результатам нуклеотидного секвенирования и проведенного сравнительного анализа фрагмента гена VP2 вы-

Выявление вирусов, вызывающих желудочно-кишечную патологию крупного рогатого скота

Таблица 2

 

Возбудитель

Выявление вирусных агентов по годам

1999

2000

2001

2002
О П % О П % О П % О П %

Ротавирус

 12 8 67 16 6 38 17 4 24 27 8 40

Коронавирус

 13 3 23 18 6 33 22 4 18 32 3 9

Парвовирус

 10 2 20 9 2 22 15 1 7 27 1 4

Вирус диареи

 -- -- 20 - 9 45 29 12 41 34 17 50

Примечание. О — количество обследованных хозяйств; П — число положительных результатов.

Таблица 3

Случаи ассоциированного течения вирусных инфекций (рота-, корона-, парвовирусная инфекции и вирусная диарея)

 

Количество возбуди­телей, выявленных одновременно в одном хозяйстве

Количество хозяйств по годам

1999

2000

2001

2002

0                        3            6            7            8 1                        6            6            7           13 2                        2            5            3            6 3                        12            10

деленных полевых изолятов ПВ КРС установили, что они имеют высокий уровень гомологии между собой и с референтными штаммами. Уровень различий между всеми имеющимися изолятами не превышает 2 %, и ни один из них не содержит аминокислотных замен на данном участке. Тем не менее полностью идентичных изолятов мы не обнаружили. Поэтому можно предположить, что при необходимости секвенирование амплифицированных фрагментов гена VP2 ПВ КРС можно использовать для дифференциации вакцинных штаммов от полевых изолятов ПВ КРС.

По статистике до 75—80 % болезней желудочно-кишечного тракта и падежа у молодняка относятся к незаразной этиологии. Данные только по 4 возбудителям показывают, что роль вирусных агентов в данной патологии чрезвычайно высока (табл. 2), а случаи выявления ассоциаций вирусов не так уж редки (табл. 3). Поэтому комплексный подход при постановке диагноза с применением высокочувствительных лабораторных методов исследования с охватом широкого круга возбудителей необходим и может изменить ситуацию.

Нельзя забывать, что гастроэнтериты телят могут быть вызваны более чем 10 видами вирусов, к которым относятся энтеро-, адено-, калици-, торо-, рео-, аст-ро-, герпесвирусы крупного рогатого скота и протекают они, в основном, в виде смешанных инфекций.

В достаточно большом количестве хозяйств мы часто сталкивались со смешанными инфекциями (2—3 возбудителя), причем, вирусы обнаруживали в разных сочетаниях. Однако были и хозяйства, в которых мы не выявили ни одного этиологического агента вирусной природы. Возможно, что там циркулировали другие вирусы из данной группы. Хотя они встречаются значительно реже, их участие в желудочно-кишечной патологии молодняка полностью игнорировать нельзя. Поэтому разработка тест-систем для выявления других вирусов, вызывающих диарейный синдром у телят, по-прежнему остается актуальной задачей. Заключение. Для выявления основных возбудителей гастроэнтеритов телят вирусной этиологии используют полимеразную цепную реакцию. С помощью секвенирования фрагментов генома проводят молекулярно-биологическую характеристику основных возбудителей этой группы (рота-, корона-, парвовиру-са и вируса диареи). Частота выявления их в хозяйствах Российской Федерации составляет 4—67 %, причем заболевания часто протекают в виде смешанных инфекций.

Журнал "Ветеринария" №2 2005

 

 

 

Реклама на сайте