Трансплантация эмбрионов
Введение.
Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение. Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. Поэтому от одной коровы можно получить в лучшем случае одного теленка в год, в то время, как в её яичнике содержатся сотни тысяч незрелых половых клеток (ооцитов), представляющих огромный генетический резерв. Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. Для этого применяется целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также на совершенствовании приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками. В перспективе биотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных и целых популяций.
В последнее время приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.(2)
Принципиальная биологиче¬ская возможность искусственного осеменения заключена в ог¬ромном «перепроизводстве» спермиев в организме самцов. Для оплодотворения яйцеклетки требуется всего один спермий, а в дозе, вводимой при искусственном осеменении, их должно быть миллионы, а организм самца производит их миллиарды. Боль¬шие биологические потенции к воспроизводству имеются и у са¬мок млекопитающих, в яичниках которых содержатся десятки и даже сотни тысяч ооцитов. Естественным путем лишь единицы из них реализуются в потомстве. В отличие от самцов препятст¬вием на пути более рационального использования воспроизво¬дительного потенциала самок млекопитающих является необхо¬димость вынашивания ими потомства в период эмбрионального развития. Это препятствие может быть устранено, если самку использовать в роли донора, только не гамет, как самца, а эм¬брионов. Для вынашивания же потомства необходим «инку¬батор».
В настоящее время для этого может быть использована един¬ственная возможность - организм приемных матерей (реципиен¬тов) того же вида. Поэтому, если одних коров использовать только в качестве доноров ранних эмбрионов, то других можно было бы использовать только в качестве реципиентов - естест¬венного инкубатора для доращивания эмбрионов. Это позволило бы интенсифицировать воспроизводство отдельных самок за счет реализации потенциальных запасов яйцеклеток в их яичниках. Таким образом, за один год от ценных племенных коров можно было бы получить не одного, а значительно большее число по¬томков. При этом в качестве приемных матерей подойдут менее продуктивные, чем доноры, коровы или просто телки, собствен¬ная продуктивность которых еще неизвестна.(3)
Отбор коров-доноров и реципиентов для трансплантации
Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов во многом зависит от клинического и физиологического состояния коров, их способности реагировать на экзогенные гонадотропины и выделять достаточное число качественных зародышей. Следовательно, одним из наиболее существенных моментов в технологии трансплантации эмбрионов, способных повысить эффективность метода является отбор доноров и реципиентов.
Исходя из того, что донор - животное высокой племенной ценности, то первое, на что обращают внимание при их отборе - это молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта данной породы, а содержание жира в молоке - на20% и более. Число учитываемых признаков может быть расширено в зависимости от поставленных селекционных целей. Например, содержание белка в молоке, пригодность к машинному доению (форма вымени, скорость молокоотдачи), крепость конституции, экстерьер и т.д. Племенная ценность донора, наряду с оценкой собственного генотипа, должна подтверждаться продуктивностью родителей. Коровы-доноры должны иметь известное происхождение, подтвержденное документально по системам групп крови. В большинстве случаев в качестве доноров используют лактирующих или выбракованных коров (не связанных с гинекологической патологией), в возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 500-650 кг, с удоем по наивысшей лактации не ниже 7 тыс. кг молока, жирностью 3,7% и более.
Не менее важным, а может и определяющим фактором при отборе доноров является состояние репродуктивных органов. Поэтому для гормональной обработки следует отбирать животных не ранее, чем через 2,5-3 месяца после отела. При этом уменьшение размеров матки до физиологически необходимых размеров не может служить гарантией готовности давать эмбрионы высокого качества. Такой гарантией может быть только проведение клинического обследования предполагаемого донора, которое при необходимости дает возможность определить направление восстановления функций размножения на основе экзогенной гормонотерапии.
Целесообразно проводить разовую индукцию полиовуляции потенциальных доноров с целью выяснения ответной реакции яичников на введение гонадотропина, после чего делается окончательное заключение о пригодности животного к использованию в технологии трансплантации. Коровы и телки с положительной ответной суперовулирующей реакцией (10 и более овуляций) и давшие не менее 4-х жизнеспособных эмбриона за первую обработку переводятся в группу постоянных доноров.
Оптимальный интервал между повторными обработками животных - 60-70 дней, в этом случае от донора можно извлекать эмбрионы до 5 раз в год. В технологии трансплантации эмбрионов коров-доноров с уровнем реакции полиовуляции до 6 желтых тел можно использовать повторно через 35-45 дней.
Дополнительными критериями отбора животных для трансплантации эмбрионов являются гормональный статус и метаболическая активность потенциальных доноров. Для получения от донора не менее 10 овуляций и 6 жизнеспособных эмбрионов необходимо, чтобы в крови коров содержание эстрадиола было на уровне 15,4 пг/мл, тестостерона - 0,18 нг/мл, ЛГ - 1,46 МЕ/л на 0-й день полового цикла, а также прогестерона - от 2,0 до 5,0 нг/мл (в среднем 3,55) и ЛГ - 1,54 МЕ/л на 10-й день полового цикла. Вызывание суперовуляции может быть эффективным при содержании в крови холестерина не менее 3,55 ммоль/л, ?-каротина - 8,88 мкмоль/л, витамина А - 4,36 мкмоль/л, активность аланинаминотрансферазы не ниже 0,24 мкмоль/л.(4)
Сервис-период более точно и намного раньше, чем интервал между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.
Сервис-период в основном зависит от интервала между отелом и первым осеменением, и интервала между первым и последним, т.е. эффективным осеменением. Высокопродуктивных коров следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это обусловлено тем, что первый половой цикл проявляется слабо, половая охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.
Первое осеменение коров на втором месяце после отела не удлиняет сервис- и межотельный период. При оптимальном сервис-периоде до 80 дней после первого и второго осеменений средняя оплодотворяемость коров составляет 95-98%, а продолжительность межотельного периода не превышает одного года.
Для оценки воспроизводительных способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры как оплодотворяемость от первого осеменения и индекс осеменения. При правильной технике осеменения и своевременном определении половой охоты оплодотворяемость коров от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.
Важным показателем воспроизводительной способности коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется высокой степенью изменчивости - коэффициент вариабельности может достигать 70%.
Существенное влияние на изменчивость индекса осеменения оказывают такие факторы, как продолжительность периода от отела до первого осеменения, своевременное выявление коров в половой охоте, оплодотворяющая способность спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном случае потенциальная корова-донор должна иметь индекс осеменения равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).(1)
В качестве реципиентов используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной ценности, живой массой 380-400 кг. Не рекомендуется использовать телок с низкой живой массой.
Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и наружные половые органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать физиологическим параметрам. При ректальном исследовании матка и яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка матки должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина рогов матки от 20 до 35 см. Яичники должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.
Исследованиями выявлена зависимость приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения реципиентов. У телок-реципиентов с нормально развитой половой системой уровень стельности в среднем составляет 57%, в то время как при отклонениях в развитии половой системы - 20%.
При отборе потенциальных реципиентов следует также учитывать параметры половой цикличности. В качестве реципиентов следует использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное снижение приживляемости зародышей на 15-20%.
При отборе потенциальных реципиентов для трансплантации существенное значение имеет определение качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.
Для более объективной оценки функциональной активности яичников и снижения эмбриональной смертности при трансплантации, наряду с диагностированием качества желтых тел, следует проводить определение концентрации стероидных гормонов и биохимических показателей крови реципиентов на 6-7 день естественного или индуцированного полового цикла.
Пересадку эмбрионов следует проводить реципиентам, независимо от качества желтого тела, с уровнем прогестерона в крови от 2,0 до 4,9 нг/мл. Соотношение прогестерона к эстрадиолу должно быть 1:10. В случае использования телок в качестве реципиентов с уровнем прогестерона свыше 5 нг/мл приживляемость снижается на 10-17%, а с уровнем ниже 2,0 нг/мл - на 25-30%. Содержание холестерина должно быть в пределах от 2,60-3,90 мкмоль/л, ?-каротина - 12,2-17,3 мкмоль/л.
После ветеринарных обработок коров и телок для трансплантации эмбрионов их можно использовать только через 3 недели. На каждого донора следует готовить 5-6 реципиентов.
Диагностика стельности реципиентов проводится ректальным методом спустя 2-3 месяца после эмбриопересадок.
Кормление доноров и реципиентов должно быть биологически полноценным. Недостаточный уровень кормления, несбалансированность рациона по общей питательности и другим жизненно важным элементам, использование кормов низкого качества ведут к нарушению обмена веществ, что оказывает отрицательное влияние на эффективность гормонального вызывания суперовуляции, качество полученных эмбрионов и их приживляемость.
Вызывание суперовуляции у коров-доноров
Для вызывания суперовуляции у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных), для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.
Опыт работы по вызыванию суперовуляции у коров-доноров сывороточными и гипофизарными препаратами показал, что при использовании гипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаются более стабильные и высокие результаты суперовуляции и эмбриопродукции (табл.1). Так, процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами, составил 75,0-78,3%, гипофизарными препаратами - 85,3-88,8%, число овуляций на донора - соответственно 8,3-9,7 и 10,2-12,0, количество пригодных эмбрионов - 3,5-4,0 и 5,5-6,1.
Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов
Синхронность проявления эструса между донором и реципиентом - важнейшее условие высокой приживляемости эмбрионов. Для синхронизации охоты используют простагландин ПГФ2-альфа или его синтетические аналоги (эстрофан, магэстрофан, ремофан, клопростенол, клатрапростин, суперфан, эстуфалан и др.).
По технологии трансплантации на каждого донора следует подготавливать не менее 5 реципиентов, причем день охоты реципиента должен совпадать с днем первого осеменения суперовулирующего донора. В случае использования в технологии трансплантации постоянных доноров (проверенных на гормональную обработку и имевших стабильный выход качественных эмбрионов) число реципиентов можно увеличить до 10.
Перед гормональной обработкой животных исследуют ректально (определяют размеры и форму яичников, наличие и выраженность желтого тела). Лютеиновая фаза цикла соответствует оптимальному времени для инъекции препаратов. Простагландины вводят внутримышечно в дозах, указанных в наставлениях по их применению. Как правило, животные приходят в охоту через 48-72 часа после инъекции препарата. Не пришедших в охоту животных обрабатывают повторно через 10-11 дней с момента первого введения ПГФ2-альфа. Двукратное введение препарата (в любую фазу полового цикла) с 10-ти дневным интервалом эффективно использовать на большом поголовье доноров и реципиентов, так как это способствует увеличению числа животных, проявивших признаки половой охоты, и снижает трудоемкость операций обслуживающего персонала.
Исследованиями установлено, что комплексное использование гормональных препаратов ФСГ, ПГФ2альфа Гн-РГ для синхронизации эструса у самок крупного рогатого скота существенно повышает эффективность работ по трансплантации. Из 50 телок, обработанных в опыте, клинически выраженную охоту проявили 88% животных, что на 11,4% больше, чем в контроле, а число реципиентов, пригодных для эмбриотрансплантации, и приживляемость пересаженных зародышей увеличилась соответственно на 15,0 и 12,2%.
Эффективность способов подготовки животных для эмбриотрансплантации
Аналогичная закономерность наблюдалась по группе коров-доноров. Количество животных, пригодных для использования в качестве доноров, увеличилось на 15,5, а число коров, положительно реагирующих полиовуляцией, на - 14,8%. В опытной группе по сравнению с контрольной повысился выход полноценных эмбрионов от донора на 24% , а выход зародышей, пригодных для пересадки, от общего числа извлеченных зародышей --14,7%.
Таким образом, комплексное использование гормональных препаратов для синхронизации эструса самок крупного рогатого скота позволяет повысить количество телок-реципиентов и коров-доноров, пригодных для эмбриотрансплантации, соответственно на 15 и 15,5%, уровень приживляемости зародышей - на 12,2%, выход полноценных эмбрионов от числа извлеченных - на 14,7%.(4)
Осеменение коров-доноров.
Результаты суперовуляции определяются эффективным осеменением коров-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все ещё остается открытой. Как показывают результаты исследований, только 60-65% эмбрионов пригодны для трансплантации, остальные яйцеклетки, образовавшиеся в результате гормональной обработки гонадотропинами, оказываются либо неоплодотворенными, либо после оплодотворения отстают в развитии или дегенерируют. Причина этих нарушений остается неизвестной.
Для искусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства. Надежным критерием наследственных качеств быка служит коэффициент повторяемости, т.е. коэффициент регрессии будущих дочерей быка на число фактически имеющихся дочерей. Если генетическое превосходство дочерей быка, выраженное величиной отклонения от сверстниц, умножить на коэффициент повторяемости, то полученная величина будет характеризовать генетическое превосходство будущих дочерей быка, или предсказанную разность. Предсказанная разность является одним из наиболее объективных качеств быка, разработанных в современной селекции молочного скота.
Для искусственного осеменения коров-доноров следует использовать, как правило, сперму производителей 1-й племенной категории, т.е. таких, племенная ценность которых превышает среднюю популяционную величину на два стандартных отклонения. В этом случае существенно повышаются темпы селекции, и улучшается племенная ценность новой генерации.
Племенной подбор быков-производителей и коров-доноров осуществляется по заказному или целевому спариванию родителей. В его основе должен лежать принцип индивидуального подбора в соответствии с селекционной программой совершенствования существующих или создания новых пород, типов и линий.
Требования к оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной для осеменения коров-доноров, должна быть значительно выше, чем при оплодотворении остальных коров. Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованием высококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременного проведения искусственного осеменения. Как правило, коров с гормонально вызванной половой охотой осеменяют дважды: первый раз при начале появления половой охоты и второй - через 12-24 часа.
В нашей стране коров-доноров искусственно осеменяют дважды в день с интервалом 10-12 часов каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы. Так как при суперовуляции повышается число овулировавших яйцеклеток, в каждой дозе спермы должно быть не менее 50 млн подвижных спермиев.
День, в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датой оплодотворения. С этого дня начинается отсчет развития эмбрионов in vivo до их извлечения.(1)
Извлечение и оценка эмбрионов.
Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов. Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора; хирургическим; нехирургическим.
Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Самым простым и надежным способом извлечения эмбрионов является убой коровы-донора. Этот способ практиковался только на первых этапах освоения метода трансплантации. В настоящее время из-за потери генетически ценной коровы-донора он не используется.
Извлечение эмбриона хирургическим способом. Важным моментом, обеспечивающим эффективность извлечения эмбрионов, является определение стадии их развития и места положения в половых путях коровы-донора. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения .
Имеется несколько способов хирургического извлечения эмбрионов: разрез верхнего свода влагалища, лапаротомия по белой линии живота и лапаротомия в области голодной ямки.
Хирургический способ извлечения эмбрионов является трудоемким, дорогостоящим и, что особенно важно, им нельзя пользоваться многократно. В настоящее время хирургический способ извлечения применяется в редких случаях, главным образом в научных целях.
Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков.
В общем виде извлечение эмбрионов нехирургическим методом происходит по следующей схеме. Коров-доноров обследуют на наличие желтых тел, чистят и моют, ограничивают рацион и кратность кормления, а за сутки прекращают кормление и поение. Перед самым извлечением эмбрионов дезинфицируют наружные половые органы коров-доноров. Извлекают эмбрионы под местной анестезией. В рог матки вводят продезинфицированный двухканальный резиновый или пластмассовый катетер с надувным баллончиком, в который нагнетают 10 куб см воздуха. Выход из рога матки закрывают, надувая воздухом тонкостенный резиновый баллончик. Затем в рог вводят промывную жидкость и осторожно массируют, чтобы отделить эмбрионы от стенок матки. В качестве промывной среды применяют PBS до 500 мл. Этот состав используется и для кратковременного культивирования эмбрионов.
Вымывание повторяют 5-8 раз. Основную часть эмбрионов извлекают в первых трех-четырех смывах. Промывание в обоих рогах матки, включая введение катетеров, продолжается 20-50 минут. За это время можно извлечь более 50% эмбрионов, находящихся на стадии морулы или бластоцисты.
После вымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотика с целью антисептики.
Во многих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлечения эмбрионов. В нашей стране успешно освоены нехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числа овулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытых яйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными. Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно не выяснены.
Кратковременное культивирование и хранение эмбрионов. Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися на предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств. Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их в другие хозяйства.
Эмбрионы крупного рогатого скота можно сохранить путем пересадки их в яйцепровод самок других видов млекопитающих. Лучше всего обеспечивается нормальное предимплантационное развитие эмбрионов коров в яйцепроводе крольчих. Установлено, что эмбрионы коровы в яйцепроводе крольчихи могут успешно развиваться до стадий, пригодных для трансплантации реципиентам, т.е. до морулы и бластоцисты. Недостатком этого метода является его трудоемкость и возможные потери зигот при их переносе. В настоящее время широкое распространение получил метод краткосрочного хранения эмбрионов in vitro.
После извлечения и оценки на жизнеспособность эмбрионы переносят в питательные среды с температурой 37 градусов. Большинство сред,
в которых культивируют и хранят эмбрионы, включают растворы солей, аминокислоты с бикарбонатным ионом как буферным агентом, обеспечивающим pH в пределах 7.2-7.6. Проведенные исследования показали, что продолжительность культивирования без потери биологических качеств эмбрионов возможна до 95 часов.
В последние годы проводятся исследования по краткосрочному хранению эмбрионов in vitro при их охлаждении ниже 37 градусов. Разработка этого метода имеет большое практическое значение, т.к. позволяет существенно упростить манипуляции с эмбрионами и надежнее обеспечивает их транспортировку.
Оценка эмбрионов. Оценка эмбрионов крупного рогатого скота производится несколькими методами. Наибольшее распространение получил морфологический метод. Установлено, что результаты имплантации эмбрионов зависят от того, насколько полно оценена способность оплодотворенных яйцеклеток к развитию.
По морфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можно классифицировать на пригодные и непригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на форму зиготы, состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.
Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом.
Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах.
Как считает М. И. Прокофьев [2], могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро, что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов.
Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.
Важнейшим критерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и других манипуляций.
При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства.
Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.
Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.
В стадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоны пеллюцида.(1)
Пересадка эмбрионов реципиентам.
В качестве реципиента отбирают гинекологически здоровых коров после двух-трех нормальных половых циклов. Для отбора реципиентов основным показателем является отсутствие гинекологических отклонений, а продуктивные, племенные и породные качества большой роли не играют. Вместе с тем, у реципиентов с плохой упитанностью, низкой оплодотворяемостью после первого осеменения, могут плохо приживаться эмбрионы. В среднем на каждого донора отбирают 5-6 реципиентов.
При современном уровне техники трансплантации рекомендуется пересаживать эмбрионы сразу после их извлечения из рогов матки донора и оценки.
В настоящее время пересадка эмбрионов реципиентам производится хирургическим и нехирургическим способами. При пересадке нужно точно знать местонахождение эмбриона в половых путях коровы. Это связано с переходом предимплантационного периода, в котором находится эмбрион до пересадки, в новый период эмбрионального развития - имплантационный. При естественном течении эмбрионального периода зародыш на стадии морулы или бластоцисты находится в верхнем отделе рога матки, поэтому и наиболее благоприятным местом для его аппликации является верхняя часть рога матки реципиента. Установлено, что пересадка эмбрионов глубоко в рог матки реципиента лучше всего обеспечивается хирургическим способом. При нехирургической же пересадке, которая происходит в период диэструса, место аппликации эмбриона в роге матки контролируется менее точно.
Эффективность хирургического способа пересадки эмбриона составляет 60-70%, а число телят - 3-4 на донора. Хирургический способ использовали в основном до середины 70-х годов. Однако он требует больших затрат средств. Кроме того, широкое применение хирургического метода сдерживается сложностью проведения операций в производственных условиях, получением травм вследствие резекции мышц, и невозможностью многократного использования реципиента. Поэтому последнее время пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом.
При нехирургической пересадке основным достоинством, кроме простоты и экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов нехирургической пересадки эмбрионов. Однако все они основаны на одном принципе - введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван также цервикальным.
После пересадки эмбрионов проводят тщательный контроль над реципиентами, обращая особое внимание на возможное проявление у них повторной половой охоты.
Для установления стельности у коров-реципиентов используют несколько методов: визуальный; по уровню прогестерона в крови или молоке; клинический, главным образом путем ректальной пальпации.
Важным звеном селекционно-племенной работы является достоверность установления истинного происхождения телят, полученных при трансплантации эмбрионов от генетически ценных родителей. Истинное происхождение можно установить по группам крови и типам белков крови. Пробу крови берут у теленка в возрасте от 4 недель до 4 месяцев.
Существенной причиной, снижающей эффективность нехирургической пересадки эмбрионов, является возможное повреждение эндометрия при введении катетера. В то же время обобщение результатов исследований по нехирургической пересадке эмбрионов показывает, что эффективность пересадки в большей степени зависит не от того, как глубоко будет введен катетер в рог матки, а от того, насколько правильно выполнено введение.
Однако на этот счет имеется и другая точка зрения , что конструкция приборов существенно не влияет на результаты извлечения и пересадки эмбрионов. Эти результаты более связаны с типом гонадотропина, квалификацией оператора, качеством и стадией развития эмбрионов.(4)
В целом же следует отметить, что нехирургический метод пересадки эмбрионов обеспечивает аппликацию зародышей в среднем 50-60%, а применение маточных релаксантов перед пересадкой- до 75%. Это существенно выше, чем при хирургическом методе. Технология нехирургического метода трансплантации сходна с искусственным осеменением коров и продолжается 3-5 минут, или 15-20 пересадок в час.
Особого внимания заслуживает приём Sertich P.L, заключающийся в нехирургической пересадке двух эмбрионов, по одному в каждый рог матки, что еще больше повышает эффективность трансплантации. Этот приём может быть применен для повышения частоты рождения разнояйцевых (дизиготных) двоен. Он позволяет получить двойные отелы у коров, особенно мясных пород, намного быстрее, чем генетическим путем (т.е. селекцией).(5)
Результаты проведенных исследований показывают, что нехирургическая пересадка дополнительного эмбриона во второй рог матки дает возможность увеличить выход новорожденных телят на 30%. При пересадке двух эмбрионов в каждый рог матки частота двоен составляет в среднем 55-60%, вместо 2% при естественном многоплодии коров.
Можно пересаживать (подсаживать) эмбрион и оплодотворенной корове, но в контрлатеральный по отношению к желтому телу в яичнике рог матки. Средняя приживляемость эмбриона осемененной корове при нехирургической подсадке составляет 50%.(Таблица 3)(4)
Обобщая результаты экспериментов по нехирургическому методу пересадки эмбрионов, можно прийти к заключению, что пересадка двух эмбрионов в два рога матки реципиента или подсадка одного предварительно осемененному реципиенту в контрлатеральный рог матки являются эффективными и перспективными методами в биотехнологии трансплантации эмбрионов.(1)
Криоконсервация эмбрионов.
Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов. Разработка метода долговременного хранения криоконсервированных эмбрионов значительно расширяет возможности трансплантации. Только в этом случае она может быть надежной биотехнологической основой селекционной программы.
Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позвозяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира. По оценке специалистов криоконсервация эмбрионов экономически оправдана, она исключает генетический дрейф, т.е. изменение частоты генов в популяции, вызванные случайными причинами.
При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50-55%. Однако нередко в производственных условиях при несоблюдении технологии замораживания-размораживания выживаемость эмбрионов уменьшается, что существенно снижает рентабельность криоконсервации. Обосновано, что использование метода криоконсервации эмбрионов в производственных условиях является рентабельным только в том случае, если выживаемость эмбрионов после размораживания будет не менее 80%, а процент стельности коров-реципиентов составит 55-60%.
По принятой в России технологии, эмбрионы замораживают с применением автоматических устройств, обеспечивающих регулирование скорости охлаждения в заданных режимах. Эмбрионы замораживают в пробирках 50x6 мм или в ампулах вместимостью 1 мл. В пробирку или ампулу вносят 1-4 эмбриона от одного донора и 0.4 мл раствора криопротектора (1.5 М ДМСО или 10%-ный раствор глицерина). Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой горелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают с 20 до -6 градусов со скоростью 1 градус в минуту, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью 0.3 градуса в минуту и погружают в жидкий азот. Применяется также и другой режим: охлаждение от -7 до -35 градусов со скоростью 0.3 градуса в минуту; от -35 до -38 градусов со скоростью 0.1 градус в минуту и погружение в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане с температурой 25 или 37 градусов в течение 10-12 секунд. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.
Практика криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота свидетельствует о том, что на выживаемость эмбрионов существенное влияние оказывает не только технология глубокого замораживания и оттаивания, но и их качество и стадия развития. Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.
Необходимость отбора эмбрионов диктуется еще и тем обстоятельством, что у 10% из них обнаруживается неправильное развитие, а при криоконсервации повреждаются в среднем еще 25% клеток бластоцисты. Такие эмбрионы испытывают большую редукцию интактных бластомеров, вследствие чего преживаемость и дальнейшее развитие после замораживания и оттаивания существенно нарушаются.
Таким образом, соблюдение правильной биотехнологии криоконсервации и пересадки эмбрионов позволит обеспечить стельность реципиентов на том же уровне, что и при пересадке свежеполученных эмбрионов. Вместе с тем метод криоконсервации в будущем может быть существенно упрощен, или вообще можно будет отказаться от удаления криопротектора и пересаживать эмбрионы реципиентам непосредственно после оттаивания без дальнейших манипуляций. По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.(2)
Эффективность использования метода трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве
На современном этапе одним из основных методов совершенствования молочного скота является искусственное осеменение. Однако оно не обеспечивает в достаточной мере ускоренного выведения животных с высокими показателями продуктивности.
В сложившейся ситуации метод трансплантации эмбрионов открывает огромные возможности в разведении и воспроизводстве крупного рогатого скота как с целью повышения эффективности племенной работы, так и увеличения производства говядины за счет получения двоен.
В настоящее время на базе интенсивного использования генетически ценных быков-производителей с применением искусственного осеменения коров темпы селекции в сравнении с обычными увеличиваются в 2-3 раза. В то же время генетический вклад в прогресс селекции матерей быков почти в 2 раза ниже вклада отцов быков. Это объясняется низкой интенсивностью селекции матерей быков и ненадежной оценкой их племенной ценности из-за получения небольшого числа потомства. В странах с развитым молочным животноводством для повышения генетического прогресса проводится интенсивный отбор коров - потенциальных матерей быков. Таких коров используют в качестве доноров генетически ценных эмбрионов. Применение технологии трансплантации эмбрионов позволяет в короткие сроки получать высокоценные маточные семейства и более точно оценивать качество потомства.
Результаты применения трансплантации на практике показывают, что этот метод позволяет получать при разовом использовании донора 2,5-3,0 теленка в год, при многократном (2-5 раз в год) - 6-20 и более телят. В тоже время, используя искусственное осеменение, от коров получают одного, в редких случаях два теленка в год.
Результаты исследований показали, что удой коров-трансплантантов был выше на 458,2 кг чем сверстниц и на 398,7 кг, чем матерей доноров (табл. 4).
Статистически достоверные различия по удою отмечены между трансплантантами и матерями-реципиентами.
Показатели жирномолочности по группам подопытных коров свидетельствуют, что первотелки, полученные методом эмбриотрансплантации, практически не отличались от своих сверстниц, а также от истинных и приемных матерей, полученных путем искусственного осеменения.
Установлено, что коровы, полученные методом трансплантации, по воспроизводительной способности не уступают сверстницам, а также матерям-донорам и матерям-реципиентам. Так, возраст первого отела у трансплантантов наступил в возрасте 27,7 мес., у сверстниц - в 28,2 мес., что указывает на хорошую скороспелость коров, полученных методом трансплантации. Индекс осеменения - низкий, как у трансплантантов, так и у коров, полученных традиционным способом. Индекс плодовитости относительно высокий и равен у трансплантантов - 48,3, у коров контрольных групп - соответственно 47,6, 48,2 и 46,0.
Результаты исследований показывают, что при подсадке одного эмбриона осемененным реципиентам выход молодняка за счет двоен увеличивается на 64,2% в расчете на один отел по сравнению с искусственным осеменением.(4)
Важно было проследить какое влияние оказывают близнецовые отелы на молочную продуктивность коров.
Продуктивность коров телившихся близнецами была значительно выше продуктивности сверстниц после одинцовых отелов. Различия отмечены как по удою, так и по содержанию жира в молоке. По первой лактации они составили 473,2 кг молока и 0,05% жира в пользу первотелок с близнецами.
Тенденция увеличения молочной продуктивности более четко прослеживается у коров по второй - четвертой лактациям. По третьей лактации различия были максимальными и составили по удою 1346,5 кг (17,3%), по содержание жира 0,14%. В целом, прибавка молока к удою за 1-4 лактации у коров после отела двойнями составила 1069 кг или 14,5%, жиру - 0,06%.
Заключение.
Таким образом, технология трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота позволила достичь параметров: выход 11-12 овуляций и 5,5-6,0 качественных эмбрионов на донора, 55 телят на 100 эмбриопересадок, себестоимость эмбриона обходится в 10-15 раз дешевле, затраты на выращивание племенного быка сокращаются в 1,5 раза .(4)
Трансплантация эмбрионов занимает прочное место в современных программах селекций. Метод трансплантации вместе с искусственным осеменением рассматривается как основа современной биотехнологии воспроизводства высокопродуктивных племенных животных, несмотря на относительно высокий уровень затрат при использовании этого метода. В настоящее время в России производится ежегодно более десяти тысяч эмбриопересадок, в будущем же планируется получать методом трансплантации не менее 25-30 тысяч телят ежегодно. Новые методы биотехнологии, по мнению ученых, в будущем приведут к коренному изменению в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота.
Список литературы:
1. Завертяев Б. П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л. «Агропромиздат», 1989.
2. Прокофьев М. И. Регуляция размножения сельскохозяйственных животных. Л., «Наука», 1983
3. Генетические основы селекции животных, М., Агропромиздат,1989.
4. Система ведения молочного скотоводства. Под общей редакцией академика ААН РБ Антонюка В.С. , Беларусь, 2002
5. Sertich, P.L. Transcervical embryo transfer in performance mares//Journal of the American Veterinary Medical Association. Oct 1, 1989. v. 195 (7)
№ кошелька: 410011987169836