Применение метода трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве

Применение метода трансплантации эмбрионов в мясном скотоводстве.

Байтлесов Ербулат Упиевич
по материалам автореферната "БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ  ИНТЕНСИФИКАЦИИ ВОСПРОИЗВОДСТВА
МАТОЧНОГО СТАДА В МЯСНОМ СКОТОВОДСТВЕ"
( диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук)
Саратов        2010
Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И.Вавилова»

Научный руководитель:     доктор ветеринарных наук, профессор Авдеенко Владимир Семенович

Характеристика жизнеспособности эмбрионов в зависимости от физиологического статуса коров. Идентификацию на основании морфологических признаков уровня развития и степени жизнеспособности эмбрионов проводили по 5-бальной шкале оценки качества: отличные эмбрионы - 5, хорошие - 4, удовлетворительные - 3, условно годные - 2, непригодные для трансплантации - 1 балл, принимая во внимание госстандарт на эмбрионы крупного рогатого скота. Дополнительно испытывали эффективность применения в качестве криопротектора этиленгликоля 1,5 М концентрации. Обобщённый анализ исследований по морфологической оценке показал, что большая часть получаемых зародышей от здоровых коров соответствует своему возрасту и стадии развития на день извлечения. Из общего числа полученных от таких коров эмбрионов, нормальных выделено 68,9%, дегенерированных - 20,8%, неоплодотворённых яйцеклеток - 10,3% (таблица 1). В исследованиях суперовуляцию вызывали гипофизарными и сывороточными гонадотропинами ФСГ-п-PgF2? по 4-х дневной схеме и ГСЖК-PgF2? по 2-х дневной схеме.

Таблица 1-  Эффективность различных технологических элементов криоконсервирования эмбрионов с учетом физиологического состояния коров-доноров

Показатели

Криопротекторы

Замораживание в газообразном азоте (метод витрификации)

Глицерин

Этилен

гликоль

1,0 М

1,4 М

Здоровые коровы-доноры

 

 

 

 

 

 

Средняя продуктив ность

 

 

 

Заморожено эмбрионов, n

200

200

299

315

Пригодные           к пересадке, n

190

187

288

257

Процент от числа замороженных

95,0

93,5

96,7

81,6

Высокая продуктив ность

 

 

 

Заморожено эмбрионов, n

78

91

38

30

Пригодные           к пересадке, n

42

72

20

15

Процент от числа замороженных

53,8

79,1

52,3

50,0

 Проблемные коровы-доноры

без учёта продук-ти

 

 

 

Заморожено эмбрионов, n

400

390

290

400

Пригодные           к пересадке, n

179

293

117

160

Процент от числа замороженных

44,9

75,0

40,3

40,0

Анализ результатов показал, что эффективность ГСЖК несколько ниже относительно количественных показателей суперовуляторной реакции, вызываемой ФСГ-п. Однако, в обоих случаях очевидно значительное влияние физиологического состояния коров-доноров на качество эмбриопродуктивности. На стадиях экспандированной бластоцисты и ранней морулы было до 32,1% эмбрионов. Доля отставших в развитии эмбрионов от высокопродуктивных и проблемных коров составила до 13,7 и 14,2%, соответственно.

Таким образом, следует констатировать, что характерная особенность эмбриогенеза у проблемных и здоровых высокопродуктивных коров заключается в снижении скорости развития эмбрионов. Опыты по культивированию эмбрионов отличного и хорошего качества показали, что наименьший процент продолживших развитие эмбрионов во всех случаях был при культивировании ранних морул. По мере увеличения возраста эмбрионов, возрастала их жизнеспособность.

Отмечая сравнительно большое число эмбрионов на ранних стадиях, не продолживших своё развитие в культивируемых условиях потеря жизнеспособности эмбрионами обусловлена наличием морфо-функциональных дефектов эмбрионов, незафиксированных методом морфологической оценки качества.

Таким образом, современные методы оценки жизнеспособности эмбрионов по морфологическим признакам не вполне совершенны, так они не позволяют определить отклонения на ультраструктурном уровне, являющиеся производными метаболических сдвигов в организме коров-доноров, вызванных патологическими процессами и/или перегруженностью обмена веществ при высокой продуктивности. Следовательно, это диктует необходимость подтверждать жизнеспособность положительно оцененных по морфологическим признакам эмбрионов (как свежеполученных, так и оттаянных после криоконсервации) методом культивирования, что позволит на 1/3 сократить непроизводительные затраты, обусловленные возможностью трансплантации нежизнеспособных эмбрионов.

Оценка качества эмбрионов мясных коров. Особое внимание обращали на колебания объема яйцеклеток, их форму, целостность, состояние прозрачной оболочки и протоплазмы, критерий уровня дробления.

Биологически полноценными считали зародыши, имеющие шарообразную форму, гомогенную цитоплазму, неповрежденную оболочку, одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным компактом. У некоторых морул отдельные клетки выпячиваются в перивителлиновое пространство, на их поверхности допустимы небольшие цитоплазматические пузырьки. У нормальной ранней бластоцисты число бластомеров составляет от 80-120, просматривается небольшая полость, поверхность клеточной массы гладкая, равномерная, перивителлиновое пространство маленькое. Морфологически нормальная поздняя бластоциста имеет утонченную прозрачную оболочку, форму правильной сферы, полость большая, перивителлиновое пространство отсутствует. Условно годными для трансплантации можно признать эмбрионы со значительными морфологическими отклонениями: сколы оболочек, наличие вакуолей, гранул в перивителлиновом пространстве, выделенном большой части бластомеров. Эмбрионы, отстающие в развитии на день вымывания с асинхронным дроблением бластомеров и наличием их грануляции относят к непригодным для трансплантации (таблица 5).

Исследования по морфологической оценке показали, что из общего числа 521 свежеполученных эмбрионов нормальных было 326 или 62,7%, дегенерированных 106 (20,3%), неоплодотворенных яйцеклеток 39 (17,0%). Результаты нехирургического извлечения эмбрионов на 7-й день цикла показали, что при гормональном вызывании суперовуляции эмбрионов отличного качества на разных стадиях развития получили незначительное количество – 20,6% от общего числа зародышей.

Таблица 2- Качество и стадия развития эмбрионов коров на 7-й день извлечения

Показатель

Всего

Стадии развития

морулы

бластоцисты

ранняя

поздняя

ранняя

поздняя

Число эмбрионов

432

47

239

104

42

Процент от общего числа

 

10,9

55,4

24,0

9,7

в т.ч. нормальных

326

22

188

84

32

процент от общего числа нормальных

75,5

6,7

57,7

25,8

9,8

дегенерированных

106-24

25-53,2

51-21,3

20-19,2

10-23,8

из них: отличных

67-20

3-13,6

22-11,7

20-23,8

22-58,8

 хороших

175-53

7-31,8

103-57,4

52-62,8

8-25,0

удовлетворительных

84-25,8

12-54,6

58-30,9

12-14,2

2-6,2

Меньше всего отличных эмбрионов на стадии ранней и поздней морулы (13,6% и 11,7%). Процент их увеличивался на стадии ранней (23,8%) и поздней бластоцисты. На стадии ранней морулы отмечен низкий процент (31,8%) эмбрионов хорошего качества и относительно высокий процент удовлетворительных эмбрионов (54,6%). Более поздние стадии характеризуются наличием высокого числа хороших эмбрионов, снижением количества удовлетворительных и условно годных.

Стадия ранней бластоцисты от поздней морулы отличалась небольшим процентом эмбрионов хорошего качества (62,0% против 57,4%) и меньшим числом удовлетворительных (14,2% и 30,9%). Для поздних бластоцист характерно наличие высокого процента эмбрионов отличного (68,8%), хорошего качества (25,0%) и небольшого числа удовлетворительных эмбрионов (6,2%). Эмбрионы коров мясных пород имели более рыхлую структуру с несколько ослабленной связью между бластомерами.

Наблюдаются некоторые различия у скорости развития одновозрастных эмбрионов у коров-доноров молочных и мясных пород. Если у молочных коров на 7-й день извлечения число поздних морул от общего числа извлеченных составляли 36%, тогда как у мясных пород 55,4%. Количество ранних бластоцист составило 24,0%. Кроме поздней морулы и ранней бластоцисты у мясных коров извлекали эмбрионы на стадии ранней морулы 10,9% и поздние бластоцисты (9,7%).

Влияние скорости охлаждения и согрева на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов. В задачу наших исследований входило установить влияние ускоренного замораживания в газообразном азоте на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов, а также сравнить эффективность различных режимов охлаждения и программные замораживатели. В первом варианте (контрольная) – охлаждение эмбрионов +20ºС до -7ºС проводили со скоростью 1ºС/мин. При достижении -7ºС осуществлялась автоматическая кристаллизация. После этого охлаждение продолжалось со скоростью 0,3ºС/мин до -35ºС, затем эмбрионы помещали в жидкий азот. В качестве замораживателя использовали сосуд Дьюара СДС-2, камеру с гнездами для соломинок из фторопласта и универсальный штатив с держателем. Скорость охлаждения регистрировали на самописце КСП-4.

Таблица 3- Влияние способа замораживателя на жизнеспособность и приживляемость эмбрионов

Показатель

Замораживатели

ЗЭМ-4

ЗЭМ- I

Газообразный азот

Заморожено и оттаяно эмбрионов

95

85

68

Жизнеспособных эмбрионов

79

69

55

Процент

83,2

81,2

80,3

Пересажено эмбрионов

79

69

55

Стельных реципиентов

31

24

20

Процент стельности

39,2

34,8

36,2

Проведенные испытания разных замораживателей показал, что жизнеспособность эмбрионов после отогрева в группах была почти одинаковой. Так, при замораживании на замораживателе ЗЭМ-1 жизнеспособных эмбрионов было 81,2%; газообразном азоте – 80,8% и на замораживателе ЗЭМ-4 – 83,2% (таблица 6). Стельность после пересадки заморожено-оттаянных эмбрионов составила 34,8%; 36,2% и 39,2% соответственно.

Сравнительные результаты испытаний 3-х моделей замораживателей показали, что любые из испытанных устройств может быть использовано с равной долей успеха в практической криобилогии.

Замораживание эмбрионов на мобильном замораживателе ЗЭМ-I и в газообразном азоте без программных замораживателей вселяет надежду, что этот технологический приём может быть эффективно применяться в экстремальных условиях ферм, где часты случаи отключения электроэнергии. Кроме того, эти устройства по габаритам небольшие и легко можно их перевозить на любом виде транспорта. Важным в консервации является оттаивание эмбрионов, которое зависит от температуры водяной бани. Нами проведены исследования по изучению влияния разных температур на жизнеспособность эмбрионов. Выживаемость эмбрионов, оттаянных при температуре водяной бани +30 ºС составило 84, 6% или на 6, 8% больше, чем при отогреве при температуре +25 ºС (77,8%). Однако процент стельности был ниже на 5,4% в первом случае.

 Финальной ступенью криоконсервирования является разбавление криопротектора в эмбрионах после их оттаивания. Обычно криопротектор добавляют многоступенчато в возрастающей концентрации с целью обеспечения равновесия внутри клеток эмбрионов.

При многоступенчатом насыщении криопротектором сохранность эмбрионов после оттаивания и стельность после пересадки была практически одинаковой (таблица 4). В связи с тем, что многоступенчатое введение криопротектора очень длительное, была сделана попытка одноступенчатого насыщения эмбриона криопротектором.

Обобщая данные исследований, можно утверждать, что выведение криопротектора раствором 0,7 М концентрации сахарозы может с равной долей успеха использовано в практике замораживания эмбрионов.

Таблица 4- Жизнеспособность и приживляемость эмбрионов при многоступенчатом насыщении криопротектором

Показатель

Замораживатели

ЗЭМ-4

ЗЭМ- I

Газообразный азот

Заморожено и оттаяно эмбрионов

55

45

38

Жизнеспособных эмбрионов

44

35

29

Процент

80,0

77,8

76,3

Пересажено эмбрионов

44

35

29

Стельных реципиентов

13

13

11

Процент стельности

40,9

37,1

37,9

Стельность после пересадки эмбрионов с поврежденной прозрачной оболочкой составляет 31,6%, что на 5,6% больше, чем у эмбрионов с выделенными бластомерами (26,3%). При наличии таких повреждений у бластоцист их приживляемость была высокой по сравнению с морулами. При пересадке бластоцист с поврежденной прозрачной оболочкой стельность была выше, чем у морул на 28,3% и при выделенных бластомерах на 19,8%. При однократном добавлении криопротектора и выведении его после оттаивания сахарозой наблюдали резкое сжатие эмбрионов. Однако, эмбрион расправлялись полностью в течение последующих 10-15 минут. Число жизнеспособных эмбрионов составляло 86,3% (95 из 110).

Количество эмбрионов с поврежденной прозрачной оболочкой или с выделенными бластомерами в группах было 28,4% и 21,0%, соответственно. Такие повреждения чаще встречались у морул (31,3 и 25,0%), чем у бластоцист (22,6 и 12,9%). Отмечены различия в морфологии заморожено-оттаянных эмбрионов в сравнении со свежеполученными. Цвет у заморожено-оттаянных эмбрионов обычно темнее, чем не замороженных, что обусловлено, очевидно, наличием погибших клеток. У таких эмбрионов часто наблюдается присутствие везикулярных включений.

Поэтому при оценке качества заморожено-оттаянных эмбрионов следует обращать внимание и на их окраску. В криоконсервировании эмбрионов выделяют несколько этапов, каждый из которых отличается друг от друга своей специфичностью. Одним их таких этапов является продолжительность хранения эмбрионов в среде от получения до их замораживания.  Продолжительность хранения эмбрионов от извлечения до замораживания отрицательно сказывается на их жизнеспособности и приживляемости после их замораживания и оттаивания.

После оттаивания и пересадки наивысший процент стельности реципиентов был 48,3% при хранении эмбрионов до замораживания не более 2-х часов. С увеличение продолжительности хранения эмбрионов от извлечения до замораживания снизилась их жизнеспособность и приживляемость после пересадки. Из приведенного следует, что хранение эмбрионов более 2-х часов от извлечения до замораживания нецелесообразно.

Биологические факторы, влияющие на жизнеспособность эмбрионов при замораживании и оттаивании. Исследованиями установлено, что жизнеспособность до и после замораживания зависит от стадии развития. Так, ранние морулы теряли жизнеспособность при охлаждении со скоростью 10ºС/мин. до 0ºС, тогда как поздние морулы успешно выдерживали замораживание. В наших исследованиях из 248 замороженных эмбрионов 9 из них находились на стадии ранней, 154 - поздней морулы, 67 -ранней и 18 – поздней бластоцисты. Пригодных для пересадки оказалось 203 (81,9%), в том числе 2 (0,9%0) ранних и 121 (78,6%) поздних морул, 67 (95,5%) ранних и 16(88,9%) поздних бластоцист. Из табл. 8 видно, что хорошие и отличные эмбрионы на стадии ранней бластоцисты значительно лучше переносили процесс замораживания (65,7%).

Сравнительно одинаковые результаты были получены при замораживании эмбрионов отличного и хорошего качества на стадии поздней морулы и бластоцисты (58,6 и 55,6%, соответственно). Исследования показали, что жизнеспособность эмбрионов мясных коров после замораживания и оттаивания непосредственно зависят от их качества до замораживания. Так эмбрионы отличного качества после оттаивания сохраняли своё первоначальное качество в 27,3%, а большая их часть (50%) перешла в группу «хорошие».

Эмбрионы хорошего качества после оттаивания 88,5% сохраняла жизнеспособность. (таблица 8) Остальные эмбрионы (11,5%) имели ухудшение морфологического состояния и их выживаемость после отогрева была низкой. Эмбрионы удовлетворительного качества только 32,6% сохранили жизнеспособность после отогрева. Поэтому эмбрионы удовлетворительного качества нецелесообразно подвергать криоконсервированию, так как после оттаивания около 70% их оказывается непригодным для пересадки. Такие эмбрионы необходимо трансплантировать сразу после извлечения или замораживать и пересаживать их после оттаивания с хорошими эмбрионами для усиления эмбрионального сигнала. После пересадки удовлетворительная приживляемость была при пересадке ранних бластоцист отличного и хорошего качества – 52,3%.

Таблица 5- Жизнеспособность эмбрионов после оттаивания на ранних стадиях развития и качества

Качество эмбрионов

До замораживания

После оттаивания

отличные

хорошие

удовлетворительные

дегенерированные

Морулы ранние (П=9)

В том числе:

хорошие (П=4)

удовлетворительные (П=5)

 

 

-

-

 

 

-

-

 

 

2-5,0

-

 

 

2-5,0

5-100,0

Морулы поздние (П=154)

В том числе:

отлично (П=27)

хорошо (П=89)

удовлетворительные (П=38)

 

 

7-25,9

-

-

 

 

15-55,6

46-51,7

-

 

 

5-18,5

34-38,2

14-36,8

 

 

-

9-10,1

24-63,2

Бластоцисты ранние (П=67)

В том числе:

отличные (П=26)

хорошие (П=41)

 

 

9-34,6

-

 

 

12-46,2

23-56,0

 

 

5-19,2

15-36,7

 

 

-

3-7,3

Бластоцисты поздние (П=18)

В том числе:

отличные (П=13)

хорошие (П=5)

 

 

2-15,4

-

 

 

6-46,1

2-40,0

 

 

5-36,5

1-20,0

 

 

-

2-40,0

Несколько ниже была приживляемость от пересадки поздних морул – 45,6% и поздних бластоцист - 40,0%. Приведенные данные показывают, что высокая жизнеспособность эмбрионов после замораживания и оттаивания, а также приживляемость после пересадки наблюдается на стадии ранней бластоцисты отличного и хорошего качества.

В наших исследованиях эмбрионы, полученные от коров-доноров после гормональной обработки ФСГ, подвергались криоконсервированию. Использовали для вызывания суперовуляции препараты гроффолон в дозе 1000 И.Е., фоллитропин -1200 И.Е. и ФСГ-п (США) - 42-50 мг.

 Высокие показатели жизнеспособности эмбрионов после замораживания и оттаивания были при обработке коров фоллитроном (88,1%) и ФСГ-п (80,9%), несколько ниже при обработке гроффолоном (70,6%). Отличных и хороших было наибольшим при использовании фоллитронина и ФСГ-п (60,5% и 63,5%), соответственно (таблица 6).

Таблица 6- Влияние ФСГ на жизнеспособность заморожено-оттаянных эмбрионов (п-%)

Показатель

ФСГ

гроффолон

фоллитропин

ФСГ-п (США)

Заморожено и оттаяно эмбрионов

17

89

142

Жизнеспособных после оттаивания

12-70,6

76-88,1

115-80,9

В том числе: отличные

-

6-6,8

11-7,7

хорошие

4-23,6

40-44,9

62-43,7

удовлетворительные

8-47,0

30-33,7

42-29,6

дегенерированные

5-29,4

13-14,6

27-19,0

При обработке гроффолоном эмбрионов отличного качества не было зарегистрировано, а процент эмбрионов хорошего качества был очень низкий (23,6%), число дегенерированных эмбрионов было наиболее высоким (29,4%). Приживляемость от пересадки эмбрионов отличного и хорошего качества, полученная от коров, обработанных ФСГ, была относительно высокая. Так, при обработке гроффолоном она составила 50,0%; фоллитропином – 43,5% и ФСГ-п – 49,3%. Эмбрионов удовлетворительного качества, количество стельных реципиентов было низким и составило 23,3 и 21,4% соотносительно.

Различия в качестве эмбрионов после замораживания и оттаивания и их приживаемости после пересадки объясняется, вероятно, их разнокачественностью препаратов, что было характерно для гроффолона.

Результаты нехирургической пересадки эмбрионов с целью получения двойных отелов. Одной из важных задач трансплантации эмбрионов мясном скотоводстве является получение двоен.

 В наших исследованиях ставилась задача выяснить возможность получения двоен у коров мясной породы при нехирургической пересадке заморожено-оттаянных эмбрионов и определить влияние некоторых факторов на результативность пересадки двух эмбрионов и пересадки одного осемененным реципиентам. В качестве реципиентов использовали коров казахской белоголовой породы 1-3 отелов. Пересаженные эмбрионы были на стадии развития поздней морулы, ранней и поздней бластоцисты отличного, хорошего и удовлетворительного качества. Было сформировано три группы коров: первой группе коров (п=30) пересаживали по одному эмбриону отличного и хорошего качества в контрлатеральный к желтому телу рог матки на 7-й день после осеменения, второй – (п=14) было пересажено 28 эмбрионов хорошего и удовлетворительного качества по два эмбриона с дегенерированным зародышем в один рог матки на стороне желтого тела, третьей (п=18) пересажено 33 эмбрионы отличного и хорошего качества в разные рога матки по одному в каждый.

 Проведенные опыты показали, что при правильном выборе метода и учете необходимых условий нехирургической пересадки реально можно получать приемлемые результаты. Наилучшая приживляемость наблюдалась при трансплантации двух эмбрионов отличного и хорошего качества в разные рога матки (50,0%0. Отмечено, что при пересадке двух эмбрионов, один из которых дегенерированный, приживляемость также может быть высокой (42,8%). Стельность от числа пересаженных эмбрионов составила 40,0; 21,4 и 25,0%. Отелы двойнями зарегистрированы в первой группе – 3(25,0%), во второй – 1 (16,7%) и в третьей – 3 (33,3%). Во второй группе одна стельная корова абортировала двойней через 90 дней после проведения ректального обследования.

Следовательно, хороших показателей двойневости у мясных коров можно добиться при трансплантации двух эмбрионов в разные рога матки, а также при контрлатеральной пересадке предварительно осемененным коровам-реципиентам. Приживляемость эмбрионов находится в прямой зависимости от качества желтого тела в яичнике на день пересадки. Так, при отличном качестве желтого тела получены высокие показатели стельности при пересадке двух эмбрионов в один рог и в два рога матки (66,7 и 75,0%0). Показатель отела в группах колебался от 40,0 до 66,7%. Высокие результаты стельности (50,0%) зарегистрированы при трансплантации двух заморожено-оттаянных эмбрионов в разные рога матки реципиента с хорошим желтым телом.

При подсадке эмбриона осемененным реципиентам с хорошим желтым телом получено 46,2% стельностей и 16,7% отелов двойнями. При пересадке двух эмбрионов в один рог матки животным с хорошим желтым телом стельность составила 42,9% при отсутствии отелов двойнями. Неудовлетворительные результаты были у реципиентов с удовлетворительными желтыми телами в яичниках, стельность составила 25,0%. При этом отмечено, что со снижением качества желтого тела процент приживляемости повышается при пересадке двух эмбрионов в один рог матки. Таким образом, с экспериментальных данных следует, что с улучшением качества желтого тела в яичнике реципиентов на день пересадки прямо пропорционально повышается процент стельности и число отелов у осемененных реципиентов.

 

 

 

 

 

Реклама на сайте